عضو شوید
عضویت سریع
تبادل لینک هوشمند 
آمار مطالب
آمار بازدید
3-1-2-مواد مصرفی29
3-2- محلول سازی29
3-2-1- ملاحظههای ایمنی واحتیاطات30
3-3-شاخص های اصلی طرح30
3-4-شمای کلی انجام طرح31
3-4-1- انجام مرحله اول پژوهش31
3-4-1-استخراج33
3-4-2-1- آماده سازی ستون ایمونوافینیتی34
3-4-1-3- تخلیص34
3-4-1-4- اسپایک گذاری34
3-4-1-5 تفسیر 35
3-4-1-6- مواد و تجهیزات آزمایش‌های انجام شده در این مرحله از پژوهش 35
3-4-1-7-محاسبات36
3-4-2-اندازه گیری آفلاتوکسین M1 در ماست36
3-4-2-1- آماده سازی و تهیه نمونه36
3-4-3- انجام مرحله سوم پژوهش36
3-4-3-1- آماده سازی و فرایند طراحی نمونه‌ها36
3-4-3-2- فراوری نمونه ها37
3-4-4-آنالیزهای مورد استفاده در این فاز پژوهش37
3-4-4-1-. اندازه گیری pH37
3-4-4-2- آزمون اسیدیته37
3-4-4-3- شمارش میکروبی37
3-4-5- انجام مرحله چهارم پژوهش38
3-4-5-1- آنالیزهای این مرحله از پژوهش38
فصل چهارم: بحث و نتیجه گیری
4-1- غلظت آفلاتوکسین40
4-1-1- مقایسه غلظت آفلاتوکسین در غلظت های05/0و1/0مایکرولیتر40
4-2- اثر تیمار های آزمایش بر تعداد باکتری لاکتوباسیلوس بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس41
4-2-1- مقایسه تعداد باکتری لاکتو باسیلوس بولگاریکوس در زمان های تخمیر41
4-2-2- مقایسه تعداد باکتری استرپتوکوکوس ترموفیلوس درزمان های تخمیر41
4–2-3- مقایسه تعداد باکتری های لاکتو باسیلوس بویگاریکوس در هفته های مختلف نگهداری دوغ42
4-2-4- مقایسه تعداد باکتری های استرپتو کوکوس ترموفیلوس در هفته های مختلف نگهداری دوغ43
4-3- اثر تیمار های آزمایش بر پی اچ و اسیدیته 43
4-3-1- مقایسه میانگین تیمار در ساعت های مختلف تخمیر برای پی اچ و اسیدیته43
4-3-2- مقایسه اثر تیمار بر پی اچ در هفته های مختلف نگهداری دوغ…………………………………………………………….44
4-3-4 مقایسه اثر تیمارهای مختلف در هفته های مختلف نگهداری دوغ برای پی اچ و اسیدیته46
4-4 بررسی تغییرات آفلاتوکسین در طی زمان تخمیر تا انتهای زمان نگهداری دوغ48
4-5 بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس واسترپتوسوکوس ترموفیلوس49
4-5-1بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های لاکتو باسیلوس بولگاریکوس49
4-5-2بررسی اثر آفلاتوکسین بر روی باکتری های استرپتوکوکوس ترموفیلوس50
4-6 اثر آفلا توکسین بر روی پی اچ51
4-7 اثر آفلاتوکسین بر روی اسیدیته51
4-8 نتیجه گیری52
4-9 پیشنهادات52
فهرست جداول
صفحه عنوان
3-1 – تجهیزات و دستگاه های مورد استفاده28
3-2- مواد مصرفی و تجهیزات مورد نیاز جهت آزمون های میکروبی29
3-3- مقادیر مورد نیاز از محلول های استاندارد کاری جهت تهیه منحنی کالیبراسیون32
4-1- جدول مقایسه غلظت آفلاتوکسین40
4-2- جدول مقایسه میانگین های pH واسیدیته طی زمان تخمیرساعت تخمیر44
4-3- جدول مقایسه میانگین pH درطی 21 روز نگهداری دوغ45
4-4- جدول مقایسه میانگین های اسیدیته درطی21 روز نگهداری دوغ46
4-5- جدول مقایسه میانگین های pH واسیدیته طی 21 روز نگهداری دوغ47
فهرست نمودارها
صفحه عنوان
نمودار3-1-منحنی کالیبراسیون33
نمودار4-1- مقایسه تعداد باکتری های لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در زمان ها ی تخمیر41
نمودار4-2- مقایسه تعداد باکتری ها استر پتوکوکوس ترموفیلوس در زمان های تخمیر42
نمودار4-3- مقایسه میانگین تعدادباکتریهای لاکتوباسیلوس بولگاریکوس در 21 روز زمان نگهداری دوغ42
نمودار4-4- مقایسه میانگین تعدادباکتریها ی استرپتوکوکوس ترموفیلوس درطی 21 روز نگهداری دوغ43
چکیده:
در این پژوهش اثر آغازگرهای لاکتیکی، لاکتوباسیلوس دلبروکی زیر گونه بولگاریکوس و استرپتوکوکوس ترموفیلوس بر روی تغییرات غلظت آفلاتوکسین M1 که در دو غلظت 05/0و1/0 مایکروگرم بر لیتر که به طور مصنوعی به شیر بازساخته در دمای 42 درجه سانتی گراد اضافه شده بود و در طی زمان تخمیر ماست و 21 روز نگهداری دوغ در یخچال، بررسی شد.محاسبه غلظت آفلاتوکسین M1 به وسیله کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا مورد بررسی قرار گرفت. شاخص های pH ، اسیدیته قابل تیتر، غلظت آفلاتوکسین وتعداد باکتری ها اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که آغازگرهای ماست تاثیر بسزایی در کاهش غلظت آفلاتوکسین داشتند. در صد کاهش غلظت آفلاتوکسین M1 در دوغ05/0 مایکروگرم بر لیتر در انتهای زمان تخمیر21% و در انتهای 21 روز نگهداری دوغ 32% بود و در دوغ 1/0 مایکروگرم بر لیتر درانتهای زمان تخمیر23% و در انتهای 21 روزنگهداری دوغ 5/34% بود. در نمونه های که دارای غلظت آفلاتوکسین بیشتری بودند کاهش رشد استرپتوکوکوس ترموفیلوس را به طور معنی داری(01/0 p< )شاهد بودیم.
لغات کلیدی:آفلاتوکسین M1 ، مایکوتوکسین، باکتری های آغاز گر ماست، زمان نگهداری، کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا.
فصل اول:
کلیات تحقیق
1-1- مقدمه
شیر و فرآورده های تخمیری آن، با داشتن ویژگی های تغذیه ای و تکنولوژیکی خاص، به عنوان حاملان باکتری های اسید لاکتیک، امروزه هدف تحقیق و توجه بسیار واقع شده اند. شیر، علاوه بر ایجاد محیطی مناسب جهت رشد و بقاء این باکتری ها، با داشتن خواص تغذیه ای ویژه خود، فرآورده ای با ارزش را به مصرف کننده عرضه می‌کند. از آنجا که شیر و فرآورده های تخمیری آن، از زمان های دور به عنوان ناقلین باکتری های مورد پذیرش بشر بوده اند، کاربرد آنها به عنوان حامل باکتری های پروبیوتیک چندان دور از ذهن نبود و قرار گرفتن این باکتری ها در این پایه، مقبولیت مصرف آن ها را برای مصرف کننده بهبود خواهد بخشید(خسروی دارانی و کوشکی.،شاه،2004.،هارلاک،2002).
مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانوی هستند که به وسیله گونه های قارچی تولید شده و بر روی انسان ،حیوانات و میکروارگانیسم ها اثر سمی دارند. تاکنون در حدود هزار نوع از مایکوتوکسین ها شناخته شده اند که حدود 30 تا 40 نوع از آن ها از نظر فرمول شیمیایی شناسایی وسمیت آن ها به اثبات رسیده است. از میان مایکوتوکسین ها ،آفلاتوکسین ها به خاطر اثرات بالقوه سرطان زایی،ناقص الخلقه زایی و جهش زایی اهمیّت بیشتری دارند و در ایجاد سرطان کبد، هپاتیت مزمن و سیروز کبد مؤثرند. آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4- هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می‌باشد که در شیر پستاندارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف میکنند، دفع میشود (آدامز و موس،2000).
آفلاتوکسین ها اغلب در محصولات کشاورزی پیش از برداشت آنها تولید می‌شوند. بعد از برداشت محصول نیز چنانچه خشک کردن آن به تأخیر بیافتد و یا درطی نگهداری در انبار، رطوبت از حد بحرانی تجاوز کند، شرایط برای رشد قارچ های مولد توکسین آماده شده و آلودگی اتفاق می‌‌افتد. آفلاتوکسین ها در انواع مختلف مواد غذایی و محصولات کشاورزی از جمله شیر، پنیر، ذرت، بادام زمینی، پنبه، گردو، فندق، بادام و انجیر شناسایی شده اند. این ترکیبات ممکن است در گوشت طیور و دام هایی که با غذای آلوده به آفلاتوکسین ها تغذیه شده اند نیز ظاهر شوند. ذرت، بادام زمینی و پنبه از محصولاتی هستند که بسیار مستعد آلودگی به آفلاتوکسین‌ها میباشند(کریم و همکاران،1378).
وجود ذرت و کنجاله پنبه آلوده به آفلاتوکسین در جیره گاو های شیری باعث آلودگی شیر و محصولات لبنی به آفلاتوکسین M1 میشود. هضم غذای آلوده به آفلاتوکسین در حیوانات منجر به دفع آفلاتوکسین M1 در شیر در طی 12 تا 24 ساعت میشود. لازم به ذکر است که فقط 2/2- 4/0 درصد از آفلاتوکسین B1 به صورت آفلاتوکسین M1 در سطح 07/0-02/0 میکروگرم در لیتر شیر میشود. مقدار آفلاتوکسین M1 و سمیت آن در شیر پس از پاستوریزاسیون شیر تغییر محسوسی پیدا نمی‌کند. از آنجایی که آفلاتوکسین M1 محلول در آب است، بنابراین با جدا کردن چربی غلظت آن در شیر افزایش می‌یابد. در جریان خامه گیری و جدا کردن چربی فقط 10و2 درصد از آفلاتوکسین M1 موجود در شیر اولیه به ترتیب به خامه و کره راه می‌یابند(اِلمر و جیمز،2001). دوغ یکی از فرآورده های تخمیری شیر است که می‌توان از ماست، آب کره و یا آب پنیر تهیه کرد. دوغ تهیه شده در این کارخانه از ماست می‌باشد و به دو نوع گازدار و بدون گاز است(حصاری و منافی،1389). در این تحقیق امکان اتصال آفلاتوکسینM1 به باکتری های لاکتیکی در دوغ بدون چربی مورد بررسی و آزمایش قرار گرفته است.
1 -2- ارائه مسأله پژوهش و بیان هدف:
1-2-1- مسأله پژوهش:
آیا امکان اتصال آفلاتوکسین 1M به باکتری های لاکتیکی در دوغ بدون چربی وجود دارد؟
1-3- اهداف تحقیق:
1-3-1- هدف کلی تحقیق:
دستیابی به روشی سالم و بدون ضرر جهت حذف سم آفلاتوکسین در فرآورده تخمیری شیر كه از نظر تغذیه(انسان) هيچگونه خطري نداشته باشد.
1-4- فرضیه ها:
فرضیه های این تحقیق شامل موارد زیر است:
الف. باکتری های لاکتیکی می‌توانند در مقادیرمختلف آفلاتوکسین تأثیر بگذارند.
ب. میزان مقادیرمختلف آفلاتوکسین می‌تواند بر باکتری های لاکتیکی تأثیر بگذارد.
پ. زمان های مختلف نگهداری در مقادیر مختلف آفلاتوکسین تأثیر معنی دار دارد.
1-5- فاکتورهای مؤثر بر فعالیت ضدقارچی باکتری های اسید لاکتیک
1-5-1- درجه حرارت و زمان گرمخانه گذاری
ردی و همکاران(1985) گزارش کردند که بیشترین تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس بعد از سه تا چهار روز گرمخانه گذاری اتفاق افتاد. ماکزیمم بازدهی ترکیبات ضدمیکروبی در دمای 25 درجه سانتی گراد بوسیله باکتری لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس S1-67- C بدست آمد(ردی و رانگاناتان،1985).
مطالعات انجام شده بوسیله سات و همکاران(2007) تشریح نمود که فعالیت ضد قارچی لاکتوباسیلوس پلانتاروم CUK501 در دمای 30 درجه سانتی گراد زمانی که کشت در انتهای فاز لگاریتمی بود، در حد ماکزیمم (1280 AU/ml) بدست آمد(ساته و همکاران،2007).
1-5-2- اثر محیط رشد
در رابطه با اثر محیط رشد بر روی تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله باکتری های اسید لاکتیک گزارشات کمی در دست است. تحقیقات نشان داده است که بهترین محیط برای تولید ترکیبات ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه لاکتیس CHD 28.3 بر علیه آسپرژیلوس فلاووس IARI در مقایسه با محیط های MRS و M17 می‌باشد(روی و همکاران،1996). در هرحال، در محیط کشت شیر، لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس میزان کمی ترکیبات ضد قارچی در مقایسه با آسپرژیلوس فومیگاتوس که قابل شناسایی با روش پراکنش(توزیع) آگار نیست،تولید می‌کند(باتیش و همکاران،1990).
1-5-3- اثر فاکتورهای تغذیه ای
ایفات و همکاران(2001) اثر فاکتورهای ضد تغذیه ای را بر روی تولید متابولیت های ضدقارچی بوسیله لاکتوباسیلوس رامنوزوس بررسی کردند و نشان داده شد که عصاره مخمر و گلوکز همانند کلرید سدیم و کلرید کلسیم تولید مواد ضدقارچی را کنترل میکنند(عفت و همکاران،2001). افزودن تا 2 درصدگلوکز به افزایش تولید متابولیت های ضد قارچی بوسیله لاکتوباسیلوس رامنوزوس منجر شد(دالی و همکاران،2010).
1-5-4- اثر pH
شرایطpH بطور مؤثری موجب کنترل تولید متابولیت های ضد قارچی بوسیله باکتری های اسید لاکتیک می‌گردد(ساته و همکاران،2007). لاکتوباسیلوس لاکتیس زیرگونه دی استی لاکتیس قادر به تولید مقادیر معنی داری از مواد ضدقارچی در محدوده نزدیک pH=5.5-7 است ، اگرچه ماکزیمم تولید در pH=6.8 گزارش شده است(باتیش و همکاران،1997).
1-6- شرایط عمومی و رشد لاکتوباسیل ها
گونه های لاکتوباسیل ها قادر به هیدرولیز ژلاتین و کازئین نبوده و نیز اندول و H2S ایجاد نمی‌کنند و درموارد خاص احیا کننده نیترات میباشند. تولید رنگدانه در آن ها نادر است. لاکتوباسیل ها در pH حدود 4/5 رشد خوبی دارند، اما تا pH حدود 2 نیز قادر به رشد بوده به این دلیل، اصطلاحاً آنها را باکتری های تحمل کننده اسید می‌نامند. بسیاری از منوساکارید ها را به کمک پِرمئازهای خود جذب کرده و در داخل یاخته های خود هیدرولیز میکنند. رشد سطحی آنها در محیط های جامد ، به طور عمده در شرایط بی هوازی و یا کاهش فشار اکسیژن موجود و حضور 5 تا 10 درصد دی اکسید کربن افزایش می‌یابد. محدوده دمایی رشد آنها بین 30 تا 52 درجه سانتی گراد و دمای بهینه آنها بین 30 تا 40 درجه سانتی گراد می‌باشد(آدامز،1988.،سروویسکا و همکاران،2002).
1-6-1- اثرات پروبیوتیک باکتریها در محصولات لبنی
کلمه پروبیوتیک از یک لغت یونانی به معنای حیات بخش گرفته شده است . استیل ول برای اولین بار کلمه ی پروبیوتیک را برای توصیف مواد ترشحی از یک موجود تک یاخته که رشد موجود دیگری را تحریک می‌نمود ، بکار برد . هاونار پروبیوتیکها را به عنوان یک کشت منفرد یا مخلوطی از M . O ها تعریف نمود که زمانی که توسط انسان یا حیوان مصرف می‌شوند با بهبود ویژگی های میکروفلور داخلی ، اثرات مفیدی را در میزبان بجای می‌گذارند(سالمینن و همکاران، 2010).
لاکتوباسیلوسها مهم ترین باکتری های پروبایوتیک انسانی هستند که برای انسان کاملاٌ ایمن وغیر بیماری زا هستند.اضافه کردن این باکتریها به شیر باعث افزایش اثر سلامت بخشی شیر و محصولات لبنی حاصل از آن و تقویت فلور میکروبی روده انسان میشود. نقش محافظتي پروبيوتيك‌ها بر عليه بيماريزاهاي روده و مكانيسم تأثیر آنها جهت انتخاب سويه‌هاي جديد براي مصارف انساني، در سالهاي اخير بسيار مورد توجه قرار گرفته است. مكانيسم اثرات سودمند پروبيوتيك‌ها بر روي ميزبان چندان شناخته نشده است. از مكانيسم‌هاي شناخته شده مي‌توان به كاهش pH روده، رقابت با بيماريزاها جهت اتصال به گيرنده‌ها و منابع غذايي، ترشح تركيبات ضد ميكروبي، غيرفعال سازي توكسين‌ها و تقويت سيستم ايمني اشاره كرد. با پيشرفت سريع علم در رابطه با رفتار باكتريهاي پروبيوتيك و باكتريهاي موجود در سطح روده انسان، امكان استفاده از تركيب گونه‌هاي مختلف پروبيوتيك جهت بهبود تأثیر آنها نسبت به يك نوع پروبيوتيك فراهم شده است. به دليل پيچيدگي فلور ميكروبي روده، تركيب پروبيوتيك‌ها جهت تأثير بر قسمت‌هاي مختلف دستگاه گوارش لازم مي‌باشد و ممكن است اثرات سلامتي بخش بر ميزبان را افزايش دهد. ابتدا در صورت انتخاب گونه‌هاي نامناسب پروبيوتيك‌ها، ممكن است تركيب آنها بي‌اثر باشد. گزارشات اندكي در رابطه با تركيب پروبيوتيك‌ها و اثرات سلامتي بخش آنها در محیط طبیعی موجود مي‌باشد.
1-6-2- ویژگی های سویه های پروبیوتیکی
معیارهای اصلی جهت انتخاب سویه های پروبیوتیکی برای مصارف غذایی انسان عبارتند از :
منشا انسانی داشته باشند .
بیماری زا نباشند .
در برابر اسید معده و محیط صفراوی مقاوم باشند .
قادر به تحمل فرآیندهای تکنولوژیکی بوده و در طی دوره ماندگاری محصول زنده باقی بمانند .
در برابر آنتی بیوتیکهای متداول مورد استفاده در مواد غذایی مقاوم باشند .
توانایی انتقال مواد ژنتیکی مانند فاکتورهای مقاومت را به میکروارگانیزم های بیماریزا نداشته باشند .
در طی عبور از دستگاه گوارش زنده مانده و توانایی چسبیدن به دیواره ی روده را داشته باشند.
با تولید مواد ضد میکروبی اثر پادزیستی در برابر میکروبهای بیماریزا داشته باشند .
اثرات مفید و سودبخش آنها بر سلامتی انسان سندیت داشته باشد.
1-6-3- مواد مورد نیاز لاکتوباسیل ها
لاکتوباسیل ها ، برای رشد به برخی اسیدهای آمینه ، پپتیدها ، اسیدهای نوکلئیک ، ویتامین ها نمک ها ، اسیدهای چرب ، استرهای اسیدهای چرب و کربوهیدرات های قابل تخمیر نیاز دارند. نیازهای غذایی عموماً برای گونه های مختلف متفاوت بوده و اغلب برای هرگونه اختصاصی است. به عبارت دیگر لاکتوباسیل ها فقط در محیط های حاوی مواد آلی پیچیده، قادر به رشد هستند و حضور اسید پانتوتنیک و اسید نیکوتنیک برای آنها الزامی است، در حالی که تیامین فقط برای رشد لاکتوباسیل های هتروفرمنتانیو ضروری می‌باشد. به علاوه اسیدفولیک، ریبوفلاوین، پیریدوکسال فسفات و پاراآمینوبنزوئیک نیز برای رشد برخی از گونه الزامی است(تسینک و همکاران،2005).
بیوتین و ویتامین B12 ، فقط برای رشد تعدادی از این باکتری ها لازم است. مطالعه روش های وابسته به ویتامین معمولاً برای ارزیابی حیاتی این باکتری ها به کار می‌رود. بسیاری از نیازهای رشد لاکتوباسیل ها به علت وجود تعدادی نقص در ژنوم آنهاست(مرتضوی و همکاران،1386).
در حالت طبیعی نیاز به مواد غذایی ضروری این باکتری ها با افزودن کربوهیدرات های قابل تخمیر ، مانند پپتون ، گوشت و عصاره مخمر بر طرف میشود. ترکیبات منگنز ، استات و توئین ـ80 ،محرک رشد هستند و در اکثر اوقات برای رشد بیشتر گونه های آنها ضروری است(رویز و هماران،1994).
1-7- قارچ آسپرژیلوس
قارچ آسپرژیلوس از سلسله آسکومیست ها،گروه پلکتومیست ها و در راسته یوروشیال ها قرار دارد. کنیدیوفر آسپرژیلوس ، عمودی و بدون انشعاب بوده و در قسمت انتهایی متورم شده و به یک سر کروی تبدیل میشود. در این دسته از قارچ ها فیالید دارای ساختمان ویژه ای است به طوری که در قسمت وسط پهن تر و در نوک باریک تر میشود. کنیدی از قسمت انتهایی فیالید جوانه می‌زند، اما به وسیله دیواره جدا نمی‌شود تا اینکه کامل رشد نماید(تجلی و همکاران،1390). پس از آن کنیدی دیگری رشد وتوسعه می‌یابد. به این ترتیب یک ردیف کنیدی شکل گرفته و همگی در یک سطح ایجاد می‌شوند.کنیدی ها خشک هستند و به آسانی به وسیله باد جدا می‌گردند. آسپرژیلوس ها جزء قارچ های ساپروفیت میباشند. در طبیعت گستردگی زیادی دارند و تعدادی از‌آن ها باعث فساد مواد غذایی می‌شوند. بعضی از انواع آسپرژیلوس ها در فراوی مواد غذایی به کار می‌روند(اینگولد و هادسون،1997).
1-8- آفلاتوکسین ها
مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانوی هستند که به وسیله گونه های قارچی تولید شده و بر روی انسان ،حیوانات و میکروارگانیسم ها اثر سمی دارند. تاکنون در حدود هزار نوع از مایکوتوکسین ها شناخته شده اند که حدود 30 تا 40 نوع از آن ها از نظر فرمول شیمیایی شناسایی و سمیت آن ها به اثبات رسیده است. از میان مایکوتوکسین ها ،آفلاتوکسین ها به خاطر اثرات بالقوه سرطان زایی ، ناقص الخلقه زایی و جهش زایی اهمیّت بیشتری دارند و در ایجاد سرطان کبد ، هپاتیت مزمن و سیروز کبد مؤثرند. سه گونه آسپرژیلوس به نام های آسپرژیلوس فلاووس ، آسپرژیلوس پارازیتیکوس ، و گونه هایی از آسپرژیلوس نومیوس قادر به تولید آفلاتوکسین ها میباشند. آسپرژیلوس فلاووس آفلاتوکسین را ایجاد می‌کند، در حالی که دو گونه دیگر هر نوع آفلاتوکسین BوG را تولید می‌نمایند(تجلی و همکاران،1390) .
آفلاتوکسین های M1 و M2 متابولیت های هیدروکسیله آفلاتوکسین های B1 و B2 هستند و در شیرو محصولات شیری دام هایی که غذای آلوده حای آفلاتوکسین B تغذیه کرده اند،یافت می‌شوند.گرچه سمیت آفلاتوکسین M1 نسبت به آفلاتوکسین B1 کمتر می‌باشد ولی وجود آن در شیر بویژه برای کوکان که مصرف بالاتری از شیر و فراورده های لبنی دارند، به عنوان یک خطر بهداشتی محسوب می‌گردد. معمولا ًمقدار آفلاتوکسین M1 در شیر بیشتر از آفلاتوکسین M2 بوده و سمیت ان نیز شدیدتر است(هولزاپفل و استین،1996).
1-8-1- آفلاتوکسین M1
آفلاتوکسین M1 دارای نقطه ذوب 299 درجه است. با استفاده از میکرو آنالیز و طیف سنجی جرمی نشان دادند که فرمول تجربی آفلاتوکسین M1 نسبت به آفلاتوکسین B1 یک اتم اکسیژن بیشتر دارد. شباهت نزدیک داده های مربوط به طیف فرابنفش آفلاتوکسین های M1 و B1 نشان می‌دهدکه سیستم کوروموفوریک در این دو ترکیب مشابه است. طیف مادون قرمز آفلاتوکسین M1 نیز مشابه B1 و دارای دو پیک در 1760cm-1 و 1690cm-1 می‌باشد. باند جذبی در 3425cm-1 نشان می‌دهد که آفلاتوکسین M1 دارای یک گروه هیدروکسیل است(هولزاپفل و استین،1996).
آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4 ـ هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می‌باشد که در شیر پستاندارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف میکنند، دفع میشود. فرمول مولکولی آن C17H12O7 است(آدامز و موس،2000).
در مطالعات مختلف چهار نوع آفلاتوکسین اصلی به نام های B1، B2، G1 و G2 شناسایی شدند. علاوه بر این، دو نوع متابولیت تولید شده از آن ها به نام های M1 و M2 که باعث آلودگی مستقیم غذای انسان و حیوانات می‌شوند، معرفی گردید(جی،1992).
هنگامی که گاو شیری غذای آلوده به آفلاتوکسین B1 را مصرف می‌کند، این نوع آفلاتوکسین به آفلاتوکسین M1 متابولیزه میشود که قسمتی از آن از طریق شیر دفع می‌گردد(المر و جیمز،2001).
نتایج مطالعات نشان می‌دهد که سرطان زایی آفلاتوکسین M1 نسبت به B1 کمتر است. با توجه به اهمیّت آفلاتوکسین ها، در سال 1997 ، 66 کشور پیشنهادی را درباره تعیین محدوده مجاز آفلاتوکسین ها در مواد غذایی مطرح کردند. بر این اساس در ایالات متحده آمریکا و نیز اتحادیه اروپا حداکثر مقدار مجارز آفلاتوکسین M1 در شیر نوشیدنی و شیر مورد استفاده به عنوان غذای کودک به ترتیب 5/0 و 1/0 قسمت در بیلیون تعیین شد(المر و جیمز،2001). با توجه به سمیت و خطرات بالقوه افلاتوکسین ها، سازمان ها و نهادهای نظارتی کشورها از جمله FDA بیشترین سطح مجاز آفلاتوکسین M1 در شیر وفراورده های شیری را تعیین کرده اند و حضور آن را در زنجیره تولید وفراوری با حساسیت کنترل میکنند. با توجه به اینکه منشأ آلودگی شیر به آفلاتوکسینM1 ، مصرف خوراک آلوده به آفلاتوکسین B1 توسط دام می‌باشد ، باید روش های مناسب تولید و نگهداری به کار گرفته شود تا خوراک دام ها تا حد امکان از آلودگی مصون بماند(مرتضوی و طباطبایی،1376).
مهمترین عامل در میزان آفلاتوکسین B1 موجود در غذا ، بدون شک درجه حرارت و رطوبت است، چرا که بعضی از قارچ ها نظیر آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس می‌توانند به آسانی در غذاهایی که رطوبت بالایی به میزان 13 و 18 درصد دارند و یا موقعی که رطوبت محیط 50 و 60 درصد است ، رشد کنند. به علاوه ، این قارچ ها در صورتی که دما زیر 25 درجه و رطوبت 85 و 90 درصد باشد ، می‌توانند تولید سم نمایند(جی،1992).
تصور میشود پایین بودن سطح آفلاتوکسین M1 در ماه ژوئن در مطالعات انجام شده توسط باکیرسی، بیشتر به خاطر چرای بیرونی دام های شیرده باشد(باکریک،2001). نتایج مشابه نیز توسط دیگر محققان به دست آمده که نشان می‌دهد که سطح پایین آفلاتوکسین M1 و یا عدم تولید آن مربوط به فصل تابستان می‌باشد(فلاح و همکاران،2009.،البرزی و همکاران،2006).
1-8-2- ساختمان شیمیایی آفلاتوکسین ها
آفلاتوکسین ها از نقطه نظر شیمیایی مشتقات فورانوکومارین محسوب می‌شوند. این ترکیبات هتروسیکلیک وزن مولکولی پایینی داشته و بر اساس منشأ اولیه ، Rf و نور فلورسانسی که در حضور اشعه فرابنفش دارند به چهار گروه اصلی B1،B2،G1 و G2 تقسیم می‌شوند. آفلاتوکسین های B1, B2 در طول موج 425 نانومتر و G1, G2 در طول موج 450 نانومتر اشعه فرابنفش به ترتیب به رنگ آبی و سبز ـ زرد فلورسانس میکنند(المر و جیمز،2001).
گونه های مسمومیت زای آسپرژیلوس به طور معمول 2 یا 3 فرم از آفلاتوکسین ها را سنتز میکنند که یکی از آن ها به طور ثابت آفلاتوکسین B1 است. آفلاتوکسین B1 سمی قوی است و در گروه ترکیبات سرطان زا قرار دارد. هنگامی که گاو شیری غذای آلوده به آفلاتوکسین را دریافت می‌کند، آفلاتوکسین B1, B2 به مشتقات 4 ـ هیدروکسی خود به نام های آفلاتوکسین M1 و M2 تبدیل و از شیر دفع می‌شوند. غلظت آفلاتوکسین M1 تولیدی در شیر گاو نسبت به آفلاتوکسین M2 بیشتر بوده و سمیت آن نیز به مراتب بیشتر می‌باشد(رحیمی و همکاران،2010). آفلاتوکسین M1 از مشتقات 4 ـ هیدروکسی آفلاتوکسین B1 می‌باشد که در شیر پستاندارانی که خوراک حاوی آفلاتوکسین B1 را مصرف میکنند، دفع میشود. فرمول مولکولی آن C17H12O7 است(آدامز و موس،2000).
1-8-3- فاکتورهای مؤثر در تولید آفلاتوکسین ها
رشد آسپرژیلوس ها و تولید آفلاتوکسین به شرایط محیطی ، نوع سوبسترا و حضور سایر گونه های قارچی بستگی دارد. با توجه به گزارش های ضد و نقیضی که در رابطه با خاصیت توکسین زایی قارچ آسپرژیلوس دردست است، محققان به این نتیجه رسیده اند که این مسئله هم به خاکی که آسپرژیلوس فلاووس از آن جدا شده و هم به منطقه جغرافیایی آن مربوط می‌باشد. منطقه جغرافیایی در تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس فلاووس نقش اساسی دارد، به طوری که به نظر می‌رسد قارچ های آسپرژیلوس که از مناطق حاره جمع آوری شده اند بیش از انواع جدا شده از مناطق معتدل ، مولد سم باشند(یوسفی،1369).
آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس در مناطق گرمسیری نیمه گرمسیری بسیار پراکنده اند. در این نوحی به علت نگهداری نامناسب محصولات کشاورزی در انبار، قارچ های مختلف از قبیل آسپرژیلوس و پنی سیلیوم به سرعت رشد میکنند. گرمای هوا و رطوبت بالا باعث میشود که میزان تولید آفلاتوکسین ها به سرعت افزایش یابد و اغلب از محدوده تعیین شده توسط FAO وWHo که 30 میکروگرم در کیلوگرم برای مصارف غذای انسان است،بالاتر رود(هولزپفل و استین،1996).
امروزه مشخص شده که تولید آفلاتوکسین ها فقط در نتیجه نگهداری نامناسب در انبار نمی‌باشد بلکه این سموم می‌توانند قبل از برداشت محصول نیز تولید شوند. استرس آبی، استرس دمایی و صدماتی که حشرات به گیاه میزبان در مزرعه وارد می‌سازند، فاکتورهای اصلی برای هجوم قارچ ها و تولید سموم قبل از برداشت محصولات می‌باشد (مرتضوی و طباطبایی،1376.، آدامز و موس،2000).
شکل گیری آفلاتوکسین ها همچنین در ارتباط با رشد سایر قارچ ها ومیکروب ها می‌باشد. آسپرژیلوس نیجر مهمترین ارگانیسم رقیب آسپرژیلوس فلاووس محسوب میشود. مطالعات انجام شده نشان دادند، درصورتی که آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس نیجر توأماً به پسته های اتوکلاو شده تلقیح شوند، آفلاتوکسین تولید نخواهد شد. مهمترین مکانیسم احتمالی در مهار تولید آفلاتوکسین کاهش pH محیط در اثر تولید مقادیر زیاد اسیدهای آلی از جمله سیتریک اسید به وسیله آسپرژیلوس می‌باشد. افزون بر این، احتمال می‌رود سیتریک اسید تولید شده توسط آسپرژیلوس نیجر از طریق جذب فلزاتی نظیر روی که برای تولید توکسین ضروری اند، به طور غیر مستقیم از تولید آن جلوگیری می‌نمایند. مکانیسم دیگر برای اثر مهارکنندگی آسپرژیلوس نیجر در تولید آفلاتوکسین، به تشکیل متابولیت ها و یا ترکیباتی نسبت داده میشود که در بیوستتز آفلاتوکسین مداخله می‌نمایند. تعدادی از حشره کش ها و علف کش ها می‌توانند مانع از رشد قارچ های آفلاتوکسین زا و تولید آفلاتوکسین توسط آنها شوند(مرتضوی و طباطبایی،1376.،اینگولد و هادسون،1997).
1-9- روش های سنجش آفلاتوکسین ها
روش های متنوعی جهت تشخیص وتعیین میزان آفلاتوکسین ها وجود دارد .در اندازه گیری کمی‌وسنجش آفلاتوکسینM1 از روش های مختلف نظیر روش های کروماتوگرافی، اسپکتروفتومتری ، بیولوژیکی و ایمونولوژیکی استفاده می‌گردد.
1-10- روش های حذف آفلاتوکسین ها
مهمترین روش های حذف آفلاتوکسین ها شامل استفاده از عوامل کلرینه کننده،عوامل اکسید کننده،عوامل هیدرولیز کننده،انواع اسیدها،ترکیبات فنلی،آنتی بیوتیک ها،آفت کش ها ، مواد جاذب و روش های بیولوژیکی می‌باشد.
1-10-1- روش های بیولوژیکی
درسال 1966، دانشمندان توانستند از میکروارگانیسم هایی مانند مخمرها، کپک ها، اکتینومیست ها، باکتری ها ، خزه و جلبک ها جهت از بین بردن آفلاتوکسین استفاده نمایند.آسپرژیلوس نیجر مهمترین عامل رقابت کننده بیولوژیک در تولید آفلاتوکسین توسط آسپرژیلوس فلاووس می‌باشد. همزیستی آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس نیجر در غلات و حبوبات وسایر تولیدات کشاورزی به طور مکرر گزارش شده است. ریزوپوس نیز قادر به تجزیه و تخریب آفلاتوکسین ها می‌باشد. علاوه بر قارچ ها باکتری ها نیز ممکن است از طریق رقابت ،تولید آفلاتوکسین را متوقف ویا آن را متابولیزه وتبدیل به ماده ای با سمیت کمتر نمایند. برای مثال نوعی باکتری به نام فلاوباکتریوم اور آنتیکوم(B-184NRRL) می‌تواند سبب تخریب آفلاتوکسین در محیط کشت شود .عمل سم زدایی این میکروارگانیسم در محیط شیر ،روغن،ذرت،کره، بادام زمینی، سبوس وبادام به اثبات رسیده است(گاریدو و همکاران،2003). بکارگیری باکتری های اسید لاکتیک به عنوان راهکاری به جهت حذف آفلاتوکسین از محیط مایع در سیستم های برون زیست پیشنهاد شده است(پییردیس و همکاران،2000.،اِل ـ نظامی و همکاران،202).
گزارشاتی در دست است که چندین گونه از باکتری های اسید لاکتیک و پروبیوتیک هایی نظیر بیفیدوباکتریوم قادر به ایجاد پیوند و یا تخریب آفلاتوکسین ها در مواد غذایی و جیره غذایی دام میباشند(پلتونن و همکارانف،2001).
در کلیه این بررسی ها مشخص شده است که فلاوباکتریوم اورآنتیکوم در حرارت 28 درجه به مدت 12 ساعت ، قادر است تمامی آفلاتوکسین ها را در محیط کشت از بین ببرد. محیط حاوی کورینه باکتریم روبروم نیز آفلاتوکسین را تجزیه می‌کند. در تحقیقی استرپتوکوکوس لاکتیس به محیط حاوی آسپرژیلوس فلاووس تلقیح شد .این عمل سبب گردید که سطح آفلاتوکسین به طور چشم گیری کاهش یابد. اثر لاکتوباسیلوس کازئی نیز بر رشد آسپرژیلوس و تولید توکسین توسط آن بررسی شد. نتایج حاصله نشان داد که مهار رشد در صورتی رخ می‌دهد که لاکتوباسیلوس کازئی و آسپرژیلوس پارازیتیکوس به طور همزمان کشت داده شوند و یا لاکتوباسیلوس قبل از افزایش کندی های آسپرژیلوس پارازیتیکوس تلقیح شود. از سوی دیگر ، چنانچه آسپرژیلوس پارازیتیکوس ابتدا رشد نماید وسپس لاکتوباسیلوس اضافه شود، هیچ مهاری در رشد و یا تولید آفلاتوکسین به چشم نمی‌خورد. نتایج مشابهی با استفاده از استرپتوکوکوس لاکتیس نیز به دست آمده است(مرتضوی و طباطبایی،1376.،گاریدو و همکاران،2003). بسیاری از مطالعات نشان داده که نژادهای باکتریایی و بیفیدوباکتریوم ها پتانسیل بالایی برای ایجاد اتصال با آفلاتوکسین ها دارند(اِ- نظامی و همکاران،1998).. اخیراً لاکتوباسیلوس ها و باکتری های اسید لاکتیک توانایی خوبی را در بعضی از آزمایشات در سیستم های برون زیستی و درون زیستی از خود نشان داده اند(اِ- نظامی و همکاران،1998،1996). در مطالعه‌ای مشخص شد که باکتری های اسید لاکتیک توانایی مناسبی برای جلوگیری از رشد مایکوتوسین هایی نظیر اُکراتوکسین در محیط مایع را دارند(پیوتروسکا و زاکوسکا،2005).
گروهی از محققین(1993) نشان دادند که باکتری های اسید لاکتیک قادر به ایجاد پیوند با موتاژن ها در سیستم برون زیست هستند که میزان موتاژن جذب شده از روده کوچک موش های رت را کاهش دادند(بولوگنانی و همکاران،1997).
مکمل سازی شیر تخمیر شده با لاکتوباسیلوس اسیدوفیلوس موجب کاهش در میزان ترشح موتاژن کل در مدفوع و اوره در مقایسه با مصرف نمونه شیر کنترل گردید. اگر چه بسیاری از دانشمندان ، فاکتورهای دیگری را نیز در امر اتصال باکتری ها و آفلاتوکسین و در نتیجه حذف این سموم دخیل می‌دانند(پلتونن و همکاران،2000).
به دلیل اثرات سمی آفلاتوکسین ها، راهکارهایی به منظور جلوگیری از رشد قارچ های تولید کننده مایکوتوکسین در مواد غذایی و جیره غذایی دام و طیور پیشنهاد شده است(کباک و همکاران،2006،2009). پیشنهاد شده که مکانیسم احتمالی اتصال باکتری ها به سموم قارچی نظیر آفلاتوکسین ها فرضیه ای مرتبط با دیواره سلول باکتری و پپتیدوگلیکان و پلی ساکاریدها می‌باشد و این دو ترکیب درحقیقت عامل اصلی اتصال مذکور هستند(بولوگنانی و همکاران،1997). آفلاتوکسین مستلزم ایجاد پیوند سموم به دیواره سلول های باکتریایی و یا ترکیبات دیواره سلول است(حاسکارد و همکاران،2001).
نشان داده شده که سطوح باکتری های پروبیوتیک نظیر بیفیدوباکتریوم و لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG بطور مؤثری به آفلاتوکسین متصل میشود.گزارشاتی در دست است که اگزوپلی ساکاریدها و لایه پپتیدوگلیکان باکتری ها عامل مهمی در ایجاد این پیوند می‌باشد. از طرفی،باکتری لاکتوباسیلوس رامنوزوس در معرض تیمار آنزیمی قرار گرفت و اثر آن بر روی ایجاد پیوند با آفلاتوکسینB1 بررسی شد.نتایج نشان داد که هیچ شاهدی مبنی بر دخالت اگزوپلی ساکارید در این مورد وجود ندارد ولی پروتئین های دیواره سلول، یون های کلسیم و منیزیم نقش تعیین کننده ای در این باره نشان دادند. مطالعات بسیاری مشخص نموده که پپتیدوگلیکان دیواره سلول بخشی اساسی در ایجاد اتصال باکتری به مایکوتوکسین هاست(لاتینن و همکاران،2007).
نتایج برخی از مطالعات نشان داده است که گونه های پروبیوتیکی نظیر لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG و لاکتوباسیلوس رامنوزوسGG نژاد LC-705 از باکتری های بسیار فعال در حذف آفلاتوکسین میباشند. این روش یکی از تکنیک های بیولوژیکی مؤثر است(اِ- نظامی و همکاران،2000). استفاده از سوش های پروبیوتیک در شیر مورد مصرف برای تولید فراورده های لبنی نظیر دوغ و ماست یکی از راهکارهای مفید در حذف آفلاتوکسین از این محصولات و نیز از دستگاه گوارش انسان می‌باشد(اِ- نظامی و همکاران،2000).
1-11- ماست
ماست یک محصول تخمیر شده لبنی است که از تخمیر شیر به وسیله استرپتوکوکوس ترموفیلوس و لاکتوباسیلوس دلبروکی زیرگونه بولگاریکوس بدست می‌آید(سایتو،2004.،کراساکوپت و همکاران،2008).
شیرهای تخمیری نظیر ماست از این جنبه با پنیر متفاوتند که در تولید آنها آنزیم رنین مورد استفاده قرار نمی‌گیرد و حالت قوام ایجاد شده در آنها ناشی از اسیدی شدن شیر توسط باکتریهای اسید لاکتیک است. ماست امروزه رایج ترین و پرمصرف ترین محصول لبنی تخمیری است(کورانا و کاناوجا،2007.،کریتندن و همکاران،2005).
فعال سازی هضم گلوسیدها و پروتئین ها، سنتز گروه های ویتامین B و ویتامین K، اسیدهای مختلف و لذا جلوگیری از گسترش فعالیت پاتوژن ها، سنتز آنتی بیوتیک ها، جلوگیری از انواع سرطان ها، توقف رشد دیسانتری، تولید دوباره باکتری های فلور روده ای در طول و بعد از درمان با آنتی بیوتیک، بهبود اگزمای پوستی، بهبود زخم ها، تسکین پوست، کمک به مشکلات گاستروانتریت، جبران کمبود ویتامین ها، رفع مشکل هضم لاکتوز در افراد مبتلا به عدم تحمل لاکتوز، رفع حساسیت های مربوط به شیر، کاهش استرس و اضطراب، بهبود هپاتیت، آنفلوآنزا، سرخک، صرع، تشنج و دیفتری ، افزایش جذب فیبرها و تقویت حافظه از مزایای استفاده از ماست می‌باشد(اَل ـ وابل و همکاران،هارلی و همکاران،2008).
1-11-1- خاصیت ضدمیکروبی ماست
ماست محصولی پی اچ پائین است که این پی اچ از طریق تولید اسید لاکتیک توسط میکروارگانیسم های آغازگر ایجاد شده و بدین ترتیب موجب می‌شوند که قابلیت نگهداری این محصول طولانی تر از شیر گردد. ماست نسبت به فساد میکروبی حساس نبوده و در حالت طبیعی، معمولاً خطری برای سلامتی در بر ندارد. بیشترین اطمینان از کیفیت محصول را می‌توان با کنترل شرایط تولید و اطمینان از کاهش یافتن مناسب پی اچ آن ، حاصل کرد. جهت ارزیابی و تضمین بهداشت عمومی محصول و بررسی آلودگی پس از پاستوریزاسیون می‌توان از آزمایشاتی که برای بررسی حضور کلی فرم ها انجام میگیرد، استفاده کرد. این موضوع، از سال 1991 میلادی که 16 مورد عفونت ناشی از مصرف ماست به توکسین های حاصل از باکتری اشرشیاکلی نسبت داده شد، از اهمیّت ویژه ای برخوردار شده است(مرتضوی و همکاران،1389).
1-12- دوغ
دوغ فرآورده اي است که از رقیق کردن ماست با آب آشامیدنی، آب معدنی، آب پنیر تخمیر شده و یا دوغ کره به دست می‌آید. این فرآورده انواع مختلفی دارد که شامل دوغ گازدار، دوغ بدون چربی گازدار، دوغ بدون گاز، دوغ بدون چربی بدون گاز میباشند(فروغی نیا و همکاران،1388).
البته لازم به ذکر است که نوع دیگري از دوغ هم به طور سنتی در ایران و برخی کشورها با تخمیر آب کره تولید میشود که از طعم و مزه بسیار مناسبی برخوردار است و طرفداران زیادي هم دارد، هر چند این نوع فرآورده ها در مقیاس غیرصنعتی و در حد کارگاهی در کشور تولید و به مصرف می‌رسند ولی بیش تر کارخانه هاي تولیدکننده فرآورده هاي شیري به دلیل به کارگیري آب کره در استاندارد کردن شیر پاستوریزه رغبت چندانی به تولید این نوع فرآورده ها ندارند. این گونه فرآورده ها در سایر کشورها از جمله ترکیه، بلژیک، دانمارك، هند، آمریکا و هلند هم مصرف داشته و از آن تحت عنوان هایی مانند
Ayran ،Acid milk drink ،Yoghurt drink نام برده میشود(فرخنده،1967).
اين فراورده از رقيق كردن ماست با آب آشاميدني ، آب پنير تخمير شده و يا دوغ كره به دست مي آيد. هم چنين، گياهان معطر خوراكي نظير نعناع، پونه، كاكوتي و يا اسانس طبيعي آنها نيز مي توانند در فرمولاسيون دوغ مورد استفاده قرار گيرند. دوغ فواید بسياري دارد كه استفاده از میکروارگانیسم هاي پروبيوتيك و تركيبات پرِبيوتيك در روند توليد مي تواند ارزش اين محصول را از نظر سلامت بخش بودن افزايش دهد(آذری کیا و همکاران،1388 .، فروغی نیا و همکاران،2007).
دوغ می‌تواند یکی از مهم ترين منابع آفلاتوكسين باشد(گالوانتو و استولوف، 1996 ،1980). آفلاتوكسين هاي M1 و M2 آفلاتوكسين هاي شير ناميده مي شوند. زماني كه آفلاتوكسين هاي B1 و B2 همراه با غذا توسط گاو شيري بلع مي شود، بخشي از آن (حدود 5/1%) در كبد حيوان هيدروكسيله گشته و به صورت آفلاتوكسين M1و M2 به داخل شير ترشح مي شود و به فراورده های آن نظیر دوغ انتقال می‌یابد(فوربیش،1986).
کیفیت شیر مورد استفاده برای تولید دوغ مانند ماست می‌باشد، ولی استاندارد چربی برای آن صفر درجه می‌باشد. دانسیته مطلوب 031/1 است و اسیدیته حداکثر 16 درجه دورنیک قابل قبول می‌باشد. چربی آن را دقیقاً استاندارد میکنند. پس از گرفتن خامۀ شیر آن را به تانک ذخیره شیر خام پمپاژ میکنند از این مرحله پاستوریزاسیون آن آغاز میشود که دمای مورد استفاده بالای 90 درجه سانتی گراد می‌باشد(کریم،1385 ).
مراحل پاستوریزاسیون و هموژنیزاسیون مانند ماست می‌باشد. پس از خنک کردن این شیر تا 50 درجه سانتی‌گراد آن را مجدداً به یکی از تانک های ذخیره شیر خام که قبلاً عملیات تمییز کردن درجا(CIP) کامل روی آن انجام گرفته منتقل میکنند. سپس آن را از طریق تانک مخلوط کن به میزان 3 درصد مایه زنی میکنند. هم زدن تانک را پس از یکنواخت شدن مایه خاموش کرده و آن را به مدت 3 الی 4 ساعت به حال خود رها میکنند تا در اثر فعالیت باکتری های مایه، لخته تشکیل شود. هنگامی که اسیدیته آن به 10 درجه دورنیک رسید، بهترین زمان برای افزودن سایر مواد است که این مواد شامل نمک، آب، اسانس نعناع و کاکوتی می‌باشد. از میان مواد فوق آب از اهمیت زیادی برخوردار است و نحوۀ اضافه کردن آن باید به گونه ای باشد که دانسیته محصول نهایی بدون احتساب نمک 026/1 تا 027/1 باشد(مرتضوی و همکاران،1385).تولید دوغ همراه با سایر فرآورده‌های لبنی تخمیری در خاورمیانه و آسیای میانه، از قدیم متداول بوده و امروزه مصرف آن در کشورهای ایران، عراق، سوریه و ترکیه بسیار رایج است. تولید صنعتی این محصول در ایران، سابقه ای بیش از 40 سال دارد. بر اساس استاندارد ملي ايران، دوغ نوشيدني حاصل از تخمير لاکتيکي شير است که ماده خشک آن از راه رقيق کردن ماست دوغ سازي (پس از تخمير) يا شير دوغ سازي پيش از تخمير استاندارد شده باشد(بی نام،1374).
فصل دوم:
سابقه و پیشینه تحقیق
2-1- مروری بر تحقیقات پیشین
جانگ در سال 2007 اثر ضد آفلاتوکسینی برخی از باکتري هاي تخمیري را مورد بررسی قرار داد. او آسپرژیلوس پارازیتیکوس را در محیط APT رشد داده و به مدت 9 روز گرمخانه گذاري کرد. آنگاه لاکتوباسیلوس کازئی و لاکتوباسیلوس پلانتارم را جداگانه به محیط اضافه کرد و به مدت 9 روز در 28 درجه سانتی گراد گرمخانه گذاري نمود. آزمایشهاي او نشان داد که لاکتوباسیلوس پلانتاروم 20.9 درصد و لاکتوباسیلوس کازئی 21.5 درصد از آسپرژیلوس پارازیتیکوس را کاهش داده است. همچنین این دو باکتري ، آفلاتوکسین B1 را به ترتیب 21.6 و 24 درصد کاهش داده اند.
در بررسی دیگری توسط ساری مهمتوگلوودر سال 2004 میزان اتصال بیفیدوباکتریوم به آفلاتوکسین B1 به میزان 46 درصد کاهش گزارش شده است.
هاسکارد و همکاران در سال 2000 فاکتورهای مؤثر بر ایجاد اتصال آفلاتوکسینB1 بوسیله لاکتوباسیلوس رامنوزوس را بررسی کرده و پیشنهاد دادند که این مایکوتوکسین بطور غالب به کربوهیدرات ها و ترکیبات پروتئینی متصل می‌گردد. این نتایج بر پایه اثرات بازدارندگی periodate و pronase E بر روی اتصال آفلاتوکسینB1 لاکتوباسیلوس رامنوزوس قرار دارد. دو ترکیب اخیر می‌توانند به طور نسبی موجب تخریب کربوهیدارت ها و پروتئین ها (به ترتیب) شوند. آفلاتوکسین M1 ، معمولاً 12 تا 24 ساعت بعد از خوردن آفلاتوکسین B1 در شیر یافت میشود(بهر،2003).
در مطالعه انجام شده توسط کریم و همکاران(1378)بر روی 73 نمونه شیرهای تحویل شده به کارخانجات شیر پاستویزه تهران از نظر وجود آفلاتوکسین M1 به روش الایزا از مجموع نمونه های آزمایش شده 13 مورد(8/17 درصد) بدون آلودگی به سم وتعداد 60 نمونه (8/82 درصد) آلوده به آفلاتوکسین M1 به میزانی بیش از حد مجاز استاندارد مورد استفاده در اتحادیه اروپا یعنی 50 نانوگرم در لیتر بوند.گزارش های موجود نشان می‌دهد که چنانچه هدف تولید شیرهایی با آلودگی کمتر از 50 نانو گرم در لیتر آفلاتوکسین باشد، باید بر روی جیره غذایی مورد مصرف دام ها دقت زیادی اعمال گردد تا مقدار آلودگی به آفلاتوکسین های BوG بیش از 2 تا 3 میکرو گرم در هر کیلو گرم نباشد(کریم و همکاران،1378).
در مطالعات انجام شده توسط سایتانو در سال1997 بر روی فراورده های شیری در تایلند، وقوع و دامنه بالایی از آفلاتوکسین M1 مشاهده شد. او نتیجه گرفت که آلودگی بالای این فراورده ها به آفلاتوکسین ممکن است به خاطر آب وهوای گرم باشد، زیرا در این شرایط درجه حرارت و رطوبت برای رشد قارچ ها و تولید آفلاتوکسین ها مناسب می‌باشد.
مطالعه انجام شده توسط گاریدو و همکاران (2003) بر روی 139 نمونه شیر شامل 79 نمونه شیر پاستوریزه و 60 نمونه شیر فرادما جمع آوری شده از سوپر مارکت های مختلف برزیل نشان داد که 20 نمونه شیر پاستوریزه(6/26 درصد) از نظر آفلاتوکسینM1 منفی بود. در 46 نمونه(2/58 درصد)آلودگی بین 15 تا 50 نانو گرم در لیتر و در 12 نمونه(2/15درصد) آلودگی بین 50 تا 500 نانو گم در لیتر به دست آمد. از 60 نمونه شیر فرادمای مورد آزمایش 7 نمونه (7/11 درصد) فاقد آلودگی ، 36 نمونه (60درصد) بین 50-15 نانوگرم در لیتر و 17 نمونه (3/28 درصد) بین 50 تا 500 نانوگرم در لیتر آلودگی نشان دادند. این نتایج نشان داد که به رغم وقوع و دامنه بالای آفلاتوکسین M1 در شیر پاستوریزه و شیر فرادمای تجاری برزیل، این سطح بر طبق مقررات تکنیکی ME Rcosul و کدکس غذایی، به عنوان خطر جدی در سلامت عمومی‌محسوب نمی‌شود(گاریو و همکاران،2003).
در ایتالیا گالوانو و همکاران در سال 1995، 159 نمونه شیر، 97 نمونه شیر خشک جهت تغذیه نوزادان و 114 نمونه ماست که بطور تصادفی از سوپرمارکت ها و فروشگاههای دارویی در چهار شهر بزرگ ایتالیا جمع آوری کردند و به روش HPLC آفلاتوکسین M1 را بررسی نمودند. آفلاتوکسینM1 در 136 نمونه شیر(86 درصد) حدود کمتر از یک نانوگرم در لیتر(که بطور متوسط 19/10 نانوگرم در لیتر)، 81 نمونه شیر خشک (84درصد) حدودکمتر از 1 نانوگرم در لیتر تا 3/101 نانوگرم در لیتر (و بطور متوسط 77/21 نانوگرم در لیتر) ودر 91 نمونه ماست (80 درصد) حدود کمتر از 1 نانوگرم در لیتر تا 496 نانوگرم در لیتر و بطور متوسط 08/18 نانوگرم در لیتر شناسایی شد. میزان آفلاتوکسینM1 شیر و ماست در دوره آبان تا فروردین چهار برابر بیشتر از نمونه های اردیبهشت تا مهر بودند.
در بررسی دیگر که توسط نامبرده روی 161 نمونه شیر، 92 نمونه شیر خشک جهت تغذیه کودکان و 120 نمونه ماست انجام شد، 125 نمونه شیر (78 درصد) حدود کمتر از 1 نانوگرم در لیتر تا 6/79 نانوگرم در لیتر(که بطور متوسط 2/32 نانوگرم در لیتر) آفلاتوکسین و در 73 نمونه ماست حدود 61 درصد کمتر از1 نانوگرم در لیتر تا 1/32 نانوگرم در لیتر(که بطور متوسط 02/9 نانوگرم در لیتر) آفلاتوکسین جدا کردند و فقط چهار نمونه بیش از حد استاندارد اروپایی بود(گالوانو و همکاران،2001). سوتیک و بانینا در سال 1979 و اِل ـ دیب در سال 1989 تغییرات مرفولوژیکی سلول های دو آغازگر ویژه ماست آلوده شده با آفلاتوکسین M1 یا آفلاتوکسین B1 در سطوح بالاتر آلودگی(1000 تا 2000 میکروگرم بر کیلوگرم) نسبت به پژوهش حاضر را مشاهده کردند. کاهشی مشخص در توانایی تخمیر باکتری های اسید لاکتیک رشد یافته در ماست آلوده شده با آفلاتوکسین B1 و مورد استفاده برای تلقیح شیر آلوده نشده مشاهده گردید. نکته این که تأخیر کوتاه در زمان تخمیر 15 دقیقه ای برای ماست های آلوده شده با سطوح بالاتر آفلاتوکسین M1 ممکن نیست در ماست دیده شود. در هر حال، تحقیقات بیشتری در این مورد لازم است. )سوتیک وبانینا ،1979).
مگالا و حافظ در سال 1982 تبدیل کامل آفلاتوکسینM1 به مشتقات هیدروکسی آفلاتوکسینM2 با غلظت در محدوده 200 تا 1000 پی.پی.بی در طول تخمیر را گزارش نمودند و نتیجه گیری شد که اسیدیته ماست مسئول تبدیل مذکور بوده و فرایند آنزیمی نیست. حسنین در سال 1994 کاهش 17 درصدی آفلاتوکسینM1 در ماست را بعد از تخمیرر گزارش نمود که این چنین کاهشی در کفیر و سایر شیرهای اسیدی شده نیز مشاهده گردیده است.
در بررسی انجام شده توسط برخی از محققین،مشاهده گردید که میزان آلودگی به آفلاتوکسین M1 در شیرهای پاییز بیشتر از بهار بود(فوکال و برزینا،1991). تحقیقات نشان می‌دهد که میزان آلودگی شیر به آفلاتوکسین تابع آلودگی غذای دام به آفلاتوکسین B1 می‌باشد(آیسیسک و همکاران،2005).
راسیک و همکاران در سال 1991 کاهش قابل توجهی از آفلاتوکسینM1 را در شیر اسیدی شده با اسید لاکتیک ، اسید سیتریک یا اسید استیک گزارش نمود. مواد جانبی دیگری نیز مانند اسیدهای چرب فرار ، اسیدهای آمینه، پپتیدها یا آلدهیدها نیز می‌توانند به تغییر یا تخریب آفلاتوکسینM1 در ماست منجر گردند.
دانشمندان فوق دریافتند که کاهش معنی دارتری از آفلاتوکسینM1 در ماست های تخمیر شده نسبت به شیر اسیدی شده با اسیدهای آلی وجود دارد و آنها نتیجه گیری نمودند که محصولات فرعی حاصل از تخمیر ممکن است مسئول کاهش بیشتر سم در ماست باشند.
از طرفی، بلانکو و همکاران در سال 1993 و ویسمن و مارت در سال 1983 گزارش کردند که به ترتیب آفلاتوکسین های B1 ، B2 ،G1 ،G2 و M1 و آفلاتوکسین M1 تغییری در ماست بعد از فرایند تخمیر نداشتند. در مقابل ، وَن اِگمون و همکاران در سال 1977 و مونکسگارد و همکاران در سال 1987 افزایش کمی در غلظت های آفلاتوکسینM1 در ماست را بعد از تخمیر گزارش نمودند که نتایج مشابه در سایر فراورده های کشت داده شده نظیر دوغ کرده مشاهده گردیده است.
یوسف و مارث در سال 1989 گزارش دادند که تخریب آفلاتوکسینM1 درpH کمتر از 4.0 بیشتر است. مطالعات دیگر پیشنهاد کرده اند که آفلاتوکسینM1 در ماست و دوغ کره در طول نگهداری در یخچال(نگهداری یخچالی) پایدار است. در مقابل ، حسنین در سال 1994 دریافت که آفلاتوکسینM1 در ماست پایدار نبوده و در حدود 59 درصد از سطح اولیه و عمده در شیر بعد از 13 روز از نگهداری در دمای کاهش می‌یابد. به طریق مشابه ، ویسمن و مارث در سال 1983 مشاهده نمود که غلظت آفلاتوکسینM1 در کفیر در حدود 40 درصد از سطح اولیه موجود در شیر بعد از دو هفته نگهداری در دمای 7 درجه سانتی گراد بود.
نتایج متناقض در ارتباط با پایداری آفلاتوکسینM1 در طول تولید و نگهداری نمونه های ماست ممکن است مربوط به فاکتورهای مختلفی نظیر تفاوت در میزان pH ماست ، غلظت های مختلف آفلاتوکسینM1 در شیر ، شرایط متفاوت تخمیر ، تغییرات در برخی از ویژگی های فیزیکوشیمیایی کازئین و کاربرد روش های آنالیتیکی نامعتبر باشد.
در مطالعات انجام شده توسط راستوگی و همکاراندر سال 2004 در هند بر روی 87 نمونه غذای شیری کودکان به روش الایزا،مشخص گردید که دامنه آلودگی به آفلاتوکسینM1 در شیر خشک کودکان(1012-65 نانو گرم در لیتر)در مقایسه با شیر مایع (164-28 نانو گرم در لیتر) بالاتر است و تقریبا 99 درصد آلودگی بالاتر از محدوده ی تعیین شده توسط استاندارد کدکس(50 نانوگرم در لیتر) به دست آمد. این در حالی بود که 9 درصد از نمونه ها آلودگی بالاتر از محدوده تعیین شده توسط FDA (500 نانو گرم در لیتر) داشتند. گزارش ها نشان می‌دهد که در بسیاری از کشورهای اروپایی ، شیر و فراورده های لبنی سطح پایینی از آلودگی با آفلاتوکسین M1 را دارند. وقوع پایین آفلاتوکسین M1 در کشورهای اروپایی شاید در نتیجه تنظیمات دقیقی است که برای آفلاتوکسینB1 در مکمل های غذایی برای گاو شیری وجود دارد(تراکسس،1999).
در کشورهای آسیایی نظیر هند ، هیچ محدودیتی برای آفلاتوکسین M1 در شیر و محصولات لبنی ثبت نشده است، بنابراین نیاز فوری به پایه گذاری یک سطح بیشینه برای آفلاتوکسین M1 در شیر و تولیدات شیر نوزاد در هند است(راستوگی و همکاران،2004). با توجه به آلودگی بالای شیرخشک ، توصیه می‌گردد که از مصرف شیرخشک در رژیم غذایی کودکان تا حد امکان جلوگیری به عمل آید و یا روش های مناسبی برای سمیت زدایی آفلاتوکسین M1 در شیر خشک تعیین گردد(سیلود و همکاران،1996.،کوره آ و همکاران،1997).
